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PCR技术的操作步骤。

归档日期:07-26       文本归类:技术操作      文章编辑:爱尚语录

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  2007年,经人力资源和社会保障部核准审批,正式审批名为《艾德职业培训学校》。已开设并即将开始的课程包括:人力资源管理师、心理咨询师、营养师、教师资格、会计、经济师、学历教育、语言、留学等。聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊DNA复制,PCR的最大特点,是能将微量的DNA大幅增加。因此,无论是化石中的古生物、历史人物的残骸,还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液,只要能分离出一丁点的DNA,就能用PCR加以放大,进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。由1983年美国Mullis首先提出设想,1985年由其发明了聚合酶链反应,即简易DNA扩增法,意味着PCR技术的线年,PCR已发展到第三代技术。1973 年,台湾科学家钱嘉韵,发现了稳定的Taq DNA聚合酶,为PCR技术发展也做出了基础性贡献。

  PCR(聚合酶链式反应)是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链,低温(经常是60°C左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合,再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72°C左右),DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5-3)的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备,能在变性温度,复性温度,延伸温度之间很好地进行控制。

  DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链,在DNA聚合酶的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,加入设计引物,DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

  但是,DNA聚合酶在高温时会失活,因此,每次循环都得加入新的DNA聚合酶,不仅操作烦琐,而且价格昂贵,制约了PCR技术的应用和发展。

  耐热DNA聚合酶--Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义,该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活,不需要每个循环加酶,使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本,PCR技术得以大量应用,并逐步应用于临床。

  PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;③引物的延伸:DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶(如TaqDNA聚合酶)的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链,重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

  DNA聚合酶链式反应技术简称PCR技术,是一种以模板DNA为基础,在引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下,利用DNA聚合酶的酶促反应,完成对模板的目的片段的快速扩增的过程,其依赖于3个温度的反复循环。

  (1)变性:即双链DNA在94℃条件下,通过热变性使模板的双链DNA氢键断裂而变成单链。

  (2)复性:即当变性温度突然降至引物Tm值(通常为35~65℃)以下时,使引物与模板DNA互补序列杂交。由于引物一般由10~25个碱基序列,模板DNA结构远比引物分子复杂,且反应体系中引物分子的浓度又远大于模板DNA,故在退火温度时,引物与模板DNA容易结合形成互补链。

  (3)延伸:在DNA聚合酶的作用下,以DNA为模板和以4种脱氧核糖核苷酸为原料,在Mg2+存在的条件下。DNA聚合酶依赖于其5→3的聚合酶活力,以引物结合于DNA模板链为起始点。使引物的序列得以延伸,合成模板DNA的互补链。

  1、BIOGHSC Super MultiProbe Master Mix包含dNTP Mix、Mg2+、BIOG热启动聚合酶、荧光保护素。2、一般来说反应体系中引物终浓度为0.2μM可得到较好的扩增效果。当反应结果不理想时,可以在0.1-1.0μM范围内调整引物浓度。3、探针终浓度可以在0.15μM-0.30μM之间调整。4、qPCR反应灵敏性高,模板量的准确性对结果影响很大,建议将模板适度稀释后加入,或用50ul反应体系。5、模板体积最好不超过反应体积的10%,操作尽量在超净台中进行,以防气溶胶污染。6、扩增产物长度请选择在100bp-500bp范围内,最好为100-200bp。 7、配制反应体系时,避免震荡混匀,以防气泡产生。8、反应条件:95℃加热6-10分钟,以激活热启动DNA聚合酶,然后95℃ 5-15秒,55-60℃ 30-60秒,40-45个循环。反应条件可根据目标片段的大小、引物的Tm值等适当调整。

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