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植物组织培养怎样进行技术操作?

归档日期:07-26       文本归类:技术操作      文章编辑:爱尚语录

  中国农业出版社(副牌:农村读物出版社)成立于1958年,是中国农业领域唯一的一家中央级大型综合性出版社。为社会奉献的图书品种累计达2万多种,总印数4亿多册。

  各种玻璃器皿均应先用洗衣粉洗净后,清水冲洗干净,放入洗液中浸24小时后用清洁水冲洗干净,再经蒸馏水冲洗一次,然后放入烘箱中烘干备用。

  洗液的配制:一般采用重铬酸钾50克,加入蒸馏水10毫升,加温溶化,冷却后再缓缓注入90毫升工业硫酸。

  (1)培养基的组成:主要成分包括各种无机盐(大量元素和微量元素)、有机化合物(蔗糖、维生素类、氨基酸、核酸或其他水解物等)、螯合剂(EDTA)和植物激素。固体培养基还应加入琼脂使培养基固化。

  经常使用的培养基,可先将各种药品配成10倍或100倍的母液,放入冰箱中保存,用时再按比例取用。

  ①大量元素:将药品称取之后,分别溶解再依顺序混合定溶,配成10倍浓度的母液,每配制1毫升培养基时取母液100毫升。

  ②微量元素:微量元素用量少,为精确、方便称取,常配成100倍或1000倍的母液。每配制1毫升培养基时取母液10毫升或1毫升。

  ③有机化合物类,同微量元素一样,可配成100倍或1000倍的母液,使用时每1毫升培养基中取用10毫升或1毫升。

  ④铁盐(螯合剂):铁盐是单独配制的,由硫酸亚铁5.57克和乙二铵四乙酸二钠7.45克,溶于1毫升水中配成,每配制1毫升培养基取用5毫升。

  ⑤植物激素:一般将植物激素配制成0.1~0.5毫克/毫升的溶液。由于植物激素多数难溶于水,可采用以下方法:

  萘乙酸(NAA):可溶于热水中或先溶于少量95%酒精中,再加水至一定浓度。

  吲哚丁酸(IBA):先用少量0.4%的NaOH溶液溶解,再加水到一定浓度。

  细胞分裂素:6-苄基嘌呤(6-BA)、激动素(KJ)需用3.65%的HCl或0.4%NaOH溶液先溶解后,再加水到一定浓度。

  以上所配制的各种母液或单独配制的各种药液,均应放入2~4℃冰箱中保存,以防变质或微生物的污染。培养基中的蔗糖和琼脂,可依需要量随用随称取。

  (2)培养基的配方:植物组织培养成功与否,在一定程度上决定于培养基的选择。不同培养基由于所含无机盐的量不同,其实验材料的反应也有差异。植物组织培养常用的培养基为MS培养基。铁盐的使用,除允许培养基用柠檬酸铁10毫克/毫升外,其余培养基都用铁盐母液5毫克/毫升。

  (3)培养基的制备程序:配置培养基时,首先按需要量依次吸取各种药液,混合在一起。将蔗糖放入溶化的琼脂中溶解,然后注入混合液,搅拌均匀后用0.4%的NaOH或3.65%的HCl溶液调节pH,再分装于三角瓶等培养容器内,用锡薄纸、羊皮纸等将容器口封紧包好。最后将分装后的培养基,放入高压灭菌锅中灭菌,一般采用1.1千克/厘米压力消毒灭菌15~20分钟,取出冷却凝固后备用。不同培养基在灭菌前应做好标记,防止混乱。

  为了得到无菌材料,在接种前必须先对植物材料进行消毒。一般采用化学试剂进行表面消毒。试剂选择及处理时间的长短,依植物材料对试剂的敏感性来决定,并且要选用消毒后容易除去的药剂,防止产生药害,影响愈合组织的发生。常用的消毒药剂有漂白粉(次氯酸钙)、安替福民(次氯酸钠),升汞等(表6-14)。在材料放入消毒剂之前,先用自来水冲洗或先在70%酒精中漂洗一下,有利于消毒剂渗入植物材料并杀死微生物,放入消毒剂消毒后,必须用无菌水认真冲洗几次,再进行接种。由于植物种类及所选用的植物器官或植物组织不同,在消毒顺序和消毒时间上也各不同。

  接种用的植物材料(外植体)的大小和形状没有严格限制,但不能太小,过小细胞分裂难以发生。因此,一般要求切块的大小要适当。接种的全过程都应在无菌条件下进行。目前都是在超净工作台上完成,将植物材料接入培养基中即可。

  植物组织培养和栽培植物一样,也受温度、光照、培养基的pH等各种环境条件的影响,培养中应严格控制培养室的条件。由于植物的种类,所取植物材料部位等的不同,所要求的环境条件也有差异。一般培养室保持在25±2℃的恒温条件,低于15℃培养物的生长停滞,高于35℃时对生长不利;光照强度为2000勒克斯,光照时间为10~12小时;对培养室内的湿度,一般不加控制,因装有培养基的容器内的湿度基本上能满足要求,外界环境的湿度过高容易造成污染;组培中培养基的pH通常为5.5~6.5。pH在4.0以下,7.0以上对生长都不利。培养不同的植物,选用不同的培养基所要求的pH也不同。

  植物组织培养能否成功,选择适合的培养基极为重要。愈合组织的生长、分化和生根,又取决于培养基中激动素和生长素的含量,过高过低都不利于生长。

  组培幼苗移栽成活,是获得大批组培苗的最后一个重要环节,常因移栽不当而遭到损失。通常试管苗具有3~5条根后即可移栽。但长期在瓶内无菌条件下培养的小苗,直接移到室外,必须经过一个过度阶段。移栽前可将试管苗先打开,放在与培养条件相近的光照充足处,锻炼3~5天,使其适应环境后再移栽。移栽时用清水洗去根上的琼脂再栽入盆中,栽植土可选用通气好的粗砂、蛭石、珍珠岩均可,为保持温度,可用塑料薄膜覆盖,这样在室内保持10~30天,就可移至大田正常生长。由组培苗改为盆栽苗又是组培育苗成败的关键之一,因此,应控制好温度、湿度及光照。各种植物对环境条件的要求不同,应区别对待。

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